Teknik Pembuatan Media Kultur Jaringan

Media Kultur Jaringan

Salah satu kesulitan dalam kultur jaringan tanaman adalah kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan optimum sangat berbeda pada tiap spesies, sehingga tidak ada media yang dapat direkomendasikan untuk semua tanaman. Penelitian – penelitian yang intensif pada kultur jaringan selama 50 tahun terakhir telah banyak mengembangkan media, beberapa diantaranya telah digunakan secara luas dalam kultur jaringan saat ini. Media ini diberikan pada Tabel 12.1. Bahan kimia dalam media biasanya ditentukan, artinya hanya hara tertentu yang dimasukkan ke dalam media, atau media dapat juga mengandung bahan tambahan kompleks seperti air kelapa atau jus jeruk yang mengandung zat pengatur tumbuh.

Komposisi Media Kultur Jaringan
Hara anorganik
Ada 12 hara mineral yang penting untuk pertumbuhan tanaman dan beberapa hara yang dilaporkan mempengaruhi pertumbuhan in vitro. Untuk pertumbuhan normal dalam kultur jaringan, unsur – unsur penting ini harus dimasukkan dalam media kultur. Perbandingan 5 media pada Tabel 12.1 memperlihatkan bahwa unsur esensial ini dimasukkan pada masing – masing media tapi konsentrasinya berbeda karena diberikan dalam bentuk yang berbeda.

Hara organik
Tanaman yang tumbuh dalam kondisi normal bersifat autotrof dan dapat mensintesa semua kebutuhan bahan organiknya. Meskipun tanaman in vitro dapat mensintesa senyawa ini, diperkirakan mereka tidak menghasilkan vitamin dalam jumlah yang cukup untuk pertumbuhan yang sehat dan satu atau lebih vitamin mesti ditambahkan ke media. Thiamin merupakan vitamin yang penting, selain itu asam nikotin, piridoksin dan inositol biasanya ditambahkan.

Selain bahan organik tersebut, bahan kompleks seringkali ditambahkan, termasuk ekstrak ragi, casein hydrolysate, air kelapa, jus jeruk, jaringan pisang, dan lain – lain. Penambahan bahan kompleks ini menghasilkan media yang tak terdefinisi. Dengan penelitian yang cukup, semestinya bahan kompleks ini dapat diganti dengan zat tertentu, mungkin tambahan suatu vitamin atau asam amino.

Sumber karbon
Tanaman dalam kultur jaringan tumbuh secara heterotrof dan karena mereka tidak cukup mensintesa kebutuhan karbonnya, maka sukrosa harus ditambahkan ke dalam media. Sumber karbon ini menyediakan energy bagi pertumbuhan tanaman dan juga sebagai bahan pembangun untuk memproduksi molekul yang lebih besar yang diperlukan untuk tumbuh.

Biasanya sukrosa pada konsentrasi 1 – 5% digunakan sebagai sumber karbon tapi sumber karbon lain seperti glukosa, maltosa, galaktosa dan laktosa juga digunakan. Ketika sukrosa diautoklaf, terjadi hidrolisis untuk menghasilkan glukosa dan fruktosa yang dapat digunakan lebih efisien oleh tanaman dalam kultur.

Agar
Umumnya jaringan dikulturkan pada media padat yang dibuat seperti gel dengan menggunakan agar atau pengganti agar sperti Gelrite atau Phytagel. Konsentrasi agar yang digunakan berkisar antara 0.7 – 1.0%. Pada konsentrasi tinggi agar menjadi sangat keras, sedikit sekali air yang tersedia, sehingga difusi hara ke tanaman sangat buruk. Agar dengan kualitas tinggi seperti Difco BiTek mahal harganya tapi lebih murni, tidak mengandung bahan lain yang mungkin mengganggu pertumbuhan. Pengganti lain seperti gelatin kadang – kadang digunakan pada lab komersial.

Gel sintetis diketahui dapat menyebabkan hyperhidration (vitrifikasi) yang merupakan problem fisiologis yang terjadi pada kultur. Untuk mengatasi masalah ini, produk baru bernaman Agargel telah diproduksi ole Sigma. Produk ini merupakan campuran agar dan gel sintetis dan menawarkan kelebihan kedua produk sekaligus mengurangi problem vitrifikasi. Produk ini dapat dibuat di lab dengan mencampurkan 1 g Gelrite (Phytagel) dengan 4 g agar sebagai agen pengental untuk 1 L media.

pH
pH media biasanya diatur pada kisaran 5.6 – 5.8 tapi tanaman yang berbeda mungkin memerlukan pH yang berbeda untuk pertumbuhan optimum. Jika pH lebih tinggi dari 6.0, media mungkin menjadi terlalu keras dan jika pH kurang dari 5.2, agar tidak dapat memadat.

Zat Pengatur Tumbuh
Pada media umumnya ditambahkan zat pengatur tumbuh. Zat pengatur tumbuh akan dibahas tersendiri pada minggu 13.

Air
Air distilata biasanya digunakan dalam kultur jaringan, dan banyak lab menggunakan aquabides (air destilata ganda). Beberapa lab, dengan alasan ekonomi, menggunakan air hujan, tapi ini menyebabkan sulit mengontrol kandungan bahan organik dan non-organik pada media.

Pemilihan Media
Jika tidak ada informasi awal, biasanya mulai dengan media MS (Murashige dan Skoog 1962). Media ini mengandung konsentrasi garam dan nitrat yang lebih tinggi dibandingkan media lain, dan telah sukses digunakan pada berbagai tanaman dikotil. Untuk inisiasi kalus, 2.4-D ditambahkan ke media dengan konsentrasi 1 – 5 mgL-1. Untuk multiplikasi tunas, sitokinin seperti BAP ditambahkan dan juga diberi auksin, seperti NAA pada konsentrasi yang rendah. Untuk inisiasi akar, IBA pada konsentrasi 1 – 2 mgL-1 ditambahkan. Faktor yang paling sulit ditentukan dalam kultur jaringan adalah zat pengatur tumbuh dan biasanya perlu melakukan penelitian kecil untuk menentukan konsentrasi terbaik yang akan digunakan. Ada 2 pendekatan: Pendekatan pertaman adalah dengan menggunakan media dasar MS dan meneliti kisaran dua zat pengatur tumbuh yang berbeda. Lihat table 12.1.

Tabel 12.1 Pendekatan eksperimental untuk memilih konsentrasi yang paling tepat dari BAP dan NAA sebagai tambahan pada media MS berisi 2% sukrosa dan 0.8% agar, Dimodifikasi dari Bhojwani dan Razdan (1983).

	BAP (mg/L)
NAA (mg/L)	0	0.5	2.5	5.0
0	1	2	3	4
0.5	5	6	7	8
2.5	9	10	11	12
5.0	13	14	15	16

Pendekatan kedua adalah dengan menggunakan metode yang lebih luas menurut deFossard (1976) diaman 4 kategori, mineral, auksin, organik dan sitokinin diuji masing – masing pada 3 konsentrasi. Percobaan yang besar ini memerlukan 81 perlakuan yang berbeda dan sangat menghabiskan waktu tapi mungkin diperlukan untuk beberapa tanaman yang sangat sulit dikulturkan.

Cara membuat media kultur jaringan

Murashige & Skooge (MS)

• Siapkan air dalam gelas piala sebanyak 500 ml 
• Timbang media MS sebanyak 4,43 gram/liter
• Timbang gula pasir sebanyak 30 gram/liter, kecuali untuk anggrek 20 gram /liter 
• Timbang agar sebanyak 7-8 gram/liter 
• Masukan media (MS), gula pasir, agar ke dalam gelas piala berisi air 500 ml satu persatu diaduk hingga rata. Tambahkan air hingga mencapai 1 liter. 
• Masak media hingga mendidih 
• Tuangkan media secara merata ke dalam botol-botol kultur jaringan

·         Untuk botol kecil sebanyak 10 ml 

·         Untuk botol selai sebanyak 20 ml

·         Untuk botol saus sebanyak 35 ml

• Botol-botol yang sudah terisi media ditutup dengan menggunakan plastik dan karet
• Media siap disterilisasi di dalam autoklaf
• Media Alternatif: Hyponex/Gandasil D atau Vitabloom D 
• Siapkan air dalam gelas piala sebanyak 500 ml 
• Timbang hiponex 2 gram/liter
• Timbang gula pasir 20 gram/liter
• Timbang agar 7-8 gram/liter
• Masukkan hiponex, gula, agar ke dalam gelas piala berisi air 500 ml satu persatu diaduk hingga rata. Tambahkan air hingga mencapai 1 liter.
• Masak media hingga mendidih
• Tuangkan media secara merata ke dalam botol-botol kultur jaringan

·         Untuk botol kecil sebanyak 10 ml 

·         Untuk botol selai sebanyak 20 ml

·         Untuk botol saus sebanyak 35 ml  

• Botol-botol yang sudah terisi media ditutup dengan menggunakan plastik dan karet
• Media siap disterilisasi di dalam autoklaf

Selain itu kita dapat membuat sendiri media tanam untuk kultur

Menggunakan media organik : kentang atau ubi untuk kultur jaringan anggrek

• Siapkan air dalam gelas piala sebanyak 500 ml 
• Siapkan air kelapa muda sebanyak 150 ml/liter
• Timbang 500 gram kentang, kupas, cuci, potong
• Rebus kentang ke dalam 1,5 liter air hingga menyusut 300 ml
• Saring air rebusan kentang
• Timbang gula pasir 20 gram/liter
• Timbang agar 7-8 gram/liter
• Timbang arang aktif 0,5 gram/liter
• Masukkan air rebusan kentang, gula, agar, arang aktif, air kelapa ke dalam gelas piala berisi air 500 ml satu persatu diaduk hingga rata. Tambahkan air hingga mencapai 1 liter.
• Masak media hingga mendidih
• Tuangkan media secara merata ke dalam botol-botol kultur jaringan

·         Untuk botol kecil sebanyak 10 ml 

·         Untuk botol selai sebanyak 20 ml

·         Untuk botol saus sebanyak 35 ml  

• Botol-botol yang sudah terisi media ditutup dengan menggunakan plastik dan karet
• Media siap disterilisasi di dalam autoklaf

Menggunakan media organik: Tomat/Pisang raja/Pisang ambon

• Siapkan air dalam gelas piala sebanyak 500 ml 
• Siapkan air kelapa muda sebanyak 150 ml/liter
• Timbang 300 gram tomat, potong, buang isinya, ambil daging buahnya d. Blender daging tomat, saring, ambil airnya.
• Timbang gula pasir 20 gram/liter
• Timbang agar 7-8 gram/liter
• Timbang arang aktif 0,5 gram/liter
• Masukkan air rebusan kentang, gula, agar, arang aktif, air kelapa ke dalam gelas piala berisi air 500 ml satu persatu diaduk hingga rata. Tambahkan air hingga mencapai 1 liter.
• Masak media hingga mendidih
• Tuangkan media secara merata ke dalam botol-botol kultur jaringan
• Untuk botol kecil sebanyak 10 ml 
• Untuk botol selai sebanyak 20 ml
• Untuk botol saus sebanyak 35 ml  
• Botol-botol yang sudah terisi media ditutup dengan menggunakan plastik dan karet
• Media siap disterilisasi di dalam autoklaf